Сложные реакции иммунодиагностики. Реакция связывания комплемента (РСК). Феномен лаковой крови. Этапы, техника реакции связывания комплемента Реакция связывания комплемента микробиология кратко

Реакция связывания комплемента является одной из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных заболеваний, а также составляет основу некоторых других методов выявления противовирусных антител. Хотя реакция нейтрализации, торможения гемагглютинации, непрямой гемагглютинации, иммуноферментный анализ превосходят реакцию связывания комплемента по чувствительности, однако простота методики, раннее обнаружение антител, а также выявление вирусных антигенов, не обладающих гемагглютинирующими свойствами, объясняют ее широкое применение в вирусологических исследованиях.

Для ее постановки не требуется такая высокая степень концентрации и чистоты антигенных препаратов, которые необходимы для ряда других иммунологических реакций. Кроме того, групповая специфичность комплементсвязывающих антигенов многих вирусов позволяет использовать реакцию связывания комплемента при массовой диагностике: эта реакция не выявляет штаммовых различий, приобретает особую ценность при изучении антигенных взаимосвязей между вирусами.

Само название в значительной мере отражает суть метода, состоящего из двух отдельных реакций. На первом этапе в реакции участвуют антигены и антитела (один из этих компонентов заранее известен), а также комплемент в оттитрованном количестве. При соответствии антигена и антител их комплекс связывает комплемент, что выявляется на втором этапе с помощью индикаторной системы (смесь бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним). Если комплемент связался при взаимодействии антигена и антител, то лизис бараньих эритроцитов не происходит (положительная реакция связывания комплемента). При отрицательной реакция связывания комплемента несвязанный комплемент способствует гемолизу, по которому судят о результатах реакции.

Основными компонентами реакции связывания комплемента служат антигены (известные или выявляемые), антитела (известные антисыворотки или исследуемые сыворотки), комплемент, гемолитическая сыворотка и эритроциты барана; в качестве разбавителя используют изотонический раствор натрия хлорида (pH 7,2-7,4) или различные буферные растворы. Антигены и сыворотки могут обладать антикомплементарностью, т.е. способностью адсорбировать комплемент, что задерживает гемолиз и искажает результат реакции.

Антигены для РСК готовят из органов зараженных животных, аллантоисной или амниотической жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также культуральной жидкости после культивирования вирусов в тканевых культурах клеток. В антигенных препаратах всегда содержится много балластных веществ из клеток животных или культур ткани, что может также исказить результаты реакции.

Полученные вирусные антигены инактивируют, определяют рабочую дозу, а также антикомплементарные и гемолитические свойства. После этого антиген титруют в присутствии комплемента.

Вторым основным компонентом при постановке реакции является комплемент. Этим термином обозначают сложную систему белков и факторов, присутствующих в крови животных и человека. Обычно в реакции связывания комплемента применяют сыворотку крови морских свинок. Активность (титр) комплемента - это его наименьшее количество, в присутствии которого гемолизин вызывает полный гемолиз используемой гемолитической системы.

Для выявления комплемент-связывающих антител к вирусам проводят обязательную инактивацию сыворотки для устранения комплемента при 560С в течение 30 мин. В качестве референс-сывороток обычно используют сыворотки иммунизированных животных. Причем для иммунизации применяют вирусные антигены, тщательно очищенные от тканевых примесей, так как к противном случае возникает выраженная неспецифическая реакция.

Обязательным компонентом реакции связывания комплемента является гемолитическая система, в которую входят эритроциты барана и гемолитическая сыворотка, полученная гипериммунизацией кроликов эритроцитами барана.

Для постановки реакции связывания комплемента используют следующие модификации: микрометод реакции связывания комплемента в микротитраторе системы Такачи, реакцию длительного связывания комплемента, реакцию непрямого связывания комплемента, реакцию связывания комплемента в геле, реакцию связывания комплемента микрокапельным методом, реакцию связывания комплемента на твердой основе.

Хотя чувствительность реакции связывания комплемента невысокая, однако она имеет высокую специфичность. В этой связи она широко применяется для диагностики вирусных пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота.

В основе реакции ле­жат два явления - бактериолизис и гемолиз. В их проявлении уча­ствует комплемент. Поэтому в РСК применяют две системы ком­понентов: 1) обеспечивает феномен бактериолизиса и использует­ся для диагностических целей; 2) гемолитическая, индикаторная, вспомогательная; позволяет установить, связался или не связался комплемент в первой системе (см. схему цв. рис. I). Ранее в каче­стве антигена использовали взвесь бактерий, поэтому первая сис­тема была названа бактериолитической (в положительных случаях происходил лизис бактерий).

Постановку РСК осуществляют в два этапа. На первом этапе готовят бактериолитическую систему: в пробирках смешивают по 0,5 мл исследуемой сыворотки с антигеном, добавляют комп­лемент в строго определенной дозе (титре). Смесь антиген - сы­воротка-комплемент (бактериолитическая система) выдержи­вают в водяной бане (или термостате) 20...40 мин при 37...38 "С. Результат взаимодействия компонентов в пробирке невидим, жидкость остается прозрачной и бесцветной. Чтобы определить, связался ли комплемент в бактериолитической системе, осуще­ствляют второй этап реакции: в пробирки добавляют компонен­ты гемолитической системы - отмытые эритроциты барана и инактивированную гемолитическую сыворотку, как показано в схеме. Все компоненты бактериолитической системы встряхива­ют для перемешивания в пробирке, помещают в водяную баню при 37...38 "С на 20...40 мин. Затем добавляют компоненты гемологической системы, вторично все встряхивают и вновь помеща­ют в водяную баню на 10...15 мин.

Предварительный учет результата. Если сы­воротка получена от больного животного, то в ней содержатся ан­титела, которые соединяются со специфическим антигеном. С этим комплексом (антиген - антитело) связывается компле­мент - гемолиз не происходит, результат положительный.

В сыворотке от здорового животного антитела отсутствуют: комплекс антиген - антитело не образуется, комплемент в бакте­риологической системе не связывается. При добавлении эритро­цитов и гемолизина (это между собой антиген и антитело) комп­лемент реагирует с этим комплексом - произойдет гемолиз, ре­зультат отрицательный (см. цв. рис. II).

Окончательный учет результата. Пробирки оставляют при комнатной температуре на 15...20 ч. Если в бакте-риолитической системе сыворотка была от больного животного, в пробирке образуется специфический комплекс антиген - антите­ло, который адсорбирует (связывает) весь добавленный компле­мент. Следовательно, во второй, гемолитической, системе гемоли­за не произойдет, эритроциты осядут на дно пробирки, надоса-дочная жидкость прозрачная. Результат РСК положительный.

Если в исследуемой сыворотке нет специфических антител к используемому антигену (в случаях, когда сыворотка от здорового животного), в бактериолитической системе комплекс антиген - антитело не образуется и, следовательно, комплемент в данной системе не адсорбируется, а остается свободным. При добавлении компонентов гемолитической системы (во второй фазе реакции) комплемент вступает во взаимодействие со вторым комплексом (гемолизин -эритроциты), происходит гемолиз эритроцитов - осадок не образуется, жидкость в пробирке лаково-красного цве­та. Результат РСК отрицательный.

РСК. используют: 1) для обнаружения в сыворотке больного животного специфических антител (при диагностике бруцеллеза, перипневмонии, сапа, лептоспироза, трипанозомоза и др.); 2) для выявления в исследуемом материале специфического антигена (бактериального или вирусного) при наличии специфической им­мунной сыворотки.

Для постановки РСК необходимо иметь: пробы сывороток, по­ступившие для исследования; две сыворотки, заведомо позитив­ные (стандартные, обеспечивающие положительный результат), и две нормальные сыворотки. Все сыворотки в разведении 1: 10 инактивируют при 56...58 °С 30 мин; антиген в разведении соглас­но титру; комплемент, разведенный в соответствии с установлен­ным титром при титровании в бактериолитической системе; гемо­лизин в рабочем титре; эритроциты барана (I: 40); физиологичес­кий раствор, градуированные пипетки, пробирки, штативы, водя­ную баню на 37...38 °С.

Перед постановкой РСК кровь барана дефибринируют, эрит­роциты отмывают физиологическим раствором путем центрифу­гирования до полной прозрачности надосадочной жидкости, ко­торую удаляют отсасыванием, а осажденные эритроциты разводят в физиологическом растворе 1:40 (2,5 %). Антиген разводят со­гласно титру, указанному на этикетке биофабрикой. Гемолизин и комплемент перед постановкой РСК титруют.

Антиген для РСК готовят на биофабриках. Обычно это экстракты разрушенных микробных взвесей {или вируссодержа-гдей ткани). Антигены не должны обладать гемолизирующим дей­ствием, что контролируется в процессе постановки реакции (в пробирку наливают 1...2 дозы антигена и 0,5 мл взвеси эритроци­тов: гемолиза не должно быть). На ампуле с антигеном биофабри­ка указывает, что он предназначен для РСК (сапной, бруцеллез­ный или другой). На упаковочной коробке указаны номер серии, дата изготовления, срок годности, активность антигена, то есть в каком разведении его надлежит использовать при постановке РСК (1:100, 1:150 и др.). При некоторых заболеваниях антигеном слу­жат другие материалы; например, для диагностики перипневмо-нии крупного рогатого скота антигеном для РСК служит лимфа теленка, экспериментально зараженного подкожно или интра-плеврально. При длительном хранении антигенов их титр вновь проверяют в лаборатории по специальной схеме титрования.

Испытуемые сыворотки, поступившие для иссле­дования, разводят физиологическим раствором 1: 5 или 1: 10, инактивируют прогреванием в водяной бане для разрушения соб­ственного комплемента 30 мин при 56...58 "С (сыворотки ослов, мулов, лошаков - при 61 °С).

Гемолизин готовят на биофабриках путем гипериммуни­зации кроликов отмытыми эритроцитами барана. Для этого кро­ликам внутривенно вводят 4...5 раз с 2...3-дневными интервалами 40...50%-ю взвесь эритроцитов. Через неделю после последней инъекции у кроликов берут кровь, стерильно отсасывают сыворот­ку, инактивируют ее, консервируют глицерином 1:1 или 0,5%-м фенолом, титруют, разливают по ампулам. В лабораториях перед постановкой РСК вновь титруют.

Схема титрования гемолизина. Необходимо подготовить: i) раз­ведение комплемента 1: 20; 2) гемолизин 1:100 (0,2 мл гемолизи­на+9,8 мл физраствора); 3) взвесь эритроцитов барана 1:40; 4) физиологический раствор NaCl.

Для постановки реакции титрования в штативе размещают два ряда пробирок - один вспомогательный только для приго­товления разведений гемолизина, второй - собственно для тит­рования. В первую пробирку каждого ряда вносят исходное раз­ведение гемолизина 1: 100, а затем производят последователь­ное разведение. Все пробирки встряхивают и помеща­ют в водяную баню при 37...38°С на 10...15 мин. Учет результата: в данном примере наименьшее количество (или его наибольшее разведение), давшее полный гемолиз, составляет 1: 2000, т. е. это его фактический титр. Рабочий титр в 2 раза кон­центрированнее - 1:1000.

По 0,5 мл (указано стрелками) каждого разведения из пробирок первого ряда переносят в отдельные пробирки второго ряда. Во все пробирки второго ряда добавляют по 0,5 мл комплемента (1: 20), по 0,5 мл эритроцитов барана (2,5%-я взвесь, или 1: 40) и по 1 мл физраствора, чтобы объем жидкости в каждой пробирке составлял 2,5 мл.

Примечание. Исходя из того что в окончательной постановке РСК будут участвовать 5 компонентов по 0,5 мл, которые составят объем 2,5 мл, на протяже­нии всей работы этот объем соблюдается.

Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню на 10...15 мин. Гемолиз прежде всего произойдет в пробирках с боль­шим содержанием гемолизина (наименьшим его разведением - 1: 500, 1:1000...). Наименьшее количество гемолизина (наиболь­шее его разведение), вызвавшее полный гемолиз эритроцитов в данных условиях, называется предельным (фактическим) титром гемолизина. Для дальнейшей работы гемолизин используют в 2 раза концентрированнее, то есть в удвоенном количестве, удвоенном титре, который называют рабочим титром. Например, если фактический титр I: 2500 (или 1: 2000), то рабочий титр соответ­ствует разведению 1:1250 (или 1: Ш00).

К о м п л е м е н т -это составная часть свежей сыворотки, лимфы, тканевых жидкостей разных видов животных (и челове­ка); открыт Бухнером (1889). У насекомых комплемент отсутству­ет. Комплемент - вещество белковой природы, сложной структу­ры, быстро инактивируется при нагревании, длительном хране­нии, воздействии ультрафиолетового излучения, сильном встря­хивании, фильтрации через керамические фильтры, добавлении каолина, кислот, щелочей, алкоголя, ацетона, хлороформа, дис­тиллированной воды, взвеси бактерий и др. Комплемент можно консервировать добавлением на 100 мл сыворотки морской свин­ки 5 г сульфата натрия, 4 г борной кислоты. Активность компле­мента при этом сохраняется до полугода. Лучший способ консер­вирования - высушивание в условиях вакуума при низкой темпе­ратуре (лиофилизация). В запаянных ампулах в таком состоянии он сохраняется два года. Перед каждой постановкой РСК актив­ность комплемента проверяют титрованием, то есть определяют его титр - оптимальное количество, необходимое для данной ре­акции. Комплемент титруют дважды: в гемолитической и бактери-олитической системах.

Для титрования комплемента в гемолитической системе готовят компоненты: комплемент в разведении 1: 20 (1 мл комплемента + 19 мл физраствора); гемолизин, разведенный соответственно ра­бочему титру; взвесь отмытых эритроцитов барана (1: 40), физио­логический раствор. В штатив ставят пробирки и разливают в них градуированной пипеткой разное количество комплемента с ин­тервалом 0,03 мл (0,13; 0,16; 0,19; 0,22..: до 0,43 мл). Затем добав­ляют остальные компоненты (рис. 57). Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37...38 "С на 10...15 мин и прово­дят учет результата.

Учет результата: наименьшее количество комплемента, обеспе­чившее полный гемолиз (в данном примере - 0,25 мл), принима­ют за титр комплемента.

Результат титрования начинают учитывать в пробирках с наи­большим содержанием комплемента, где прежде всего ожидается гемолиз. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный гемолиз эритроцитов при данных условиях, называют титром комплемента в гемолитической системе.

Для титрования комплемента в бактериолитической системе необходимо иметь все компоненты реакции: комплемент (1:20), эритроциты (1: 40), гемолизин в рабочем титре, две позитивные и две нормальные сыворотки, специфический антиген. Сыворотки разводят физраствором 1: 10, инактивируют 30 мин при 56...58 X. Каждую сыворотку разливают в два ряда пробирок по 0,5 мл. В пробирки каждого ряда добавляют комплемент в возрастающих количествах, как при титровании в гемолитической системе; на­чинают с количества, принятого за титр в гемолитической систе­ме, затем в каждой последующей пробирке дозу увеличивают на 0,03 мл, выравнивая объем до 0,5 мл физиологическим раствором.

После этого в один ряд пробирок с позитивной и нормальной сы­воротками добавляют по 0,5 мл антигена, во второй ряд каждой сы­воротки-по 0,5 мл физиологического раствора. Все пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 30...40мин. Затем во все пробирки вносят по 0,5 мл гемолизина и по 0,5 мл эритроцитов, встряхивают и вторично помещают в водяную баню на 10...15 мин. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный лизис эритроцитов в обоих рядах пробирок (с антигеном и без антигена) двух нормальных сывороток, в одном ряду (без антигена) каждой по­зитивной сыворотки и с полной задержкой (отсутствием) гемолиза в рядах позитивных сывороток с антигеном (в тех же дозах комплемен­та), называют титром комплемента, который используют в поста­новке главного опыта РСК при диагностических исследованиях.

Главный опыт РСК (собственно диагностическое исследование). В штативы ставят два ряда пробирок по количеству исследуемых проб сывороток. По 0,5 мл каждой инактивирован-ной сыворотки наливают в две пробирки: в одну добавляют анти­ген - 0,5 мл, в другую (без антигена) 0,5 мл физраствора и, доба­вив комплемент, составляют бактернолитическую систему, а затем добавляют гемолитическую.

Необходимые компоненты: 1) исследуемая сыворотка, инактивированная, разве­денная физиологическим раствором 1: 10; 2) специфический ан­тиген, разведенный согласно титру, указанному биофабрикой на этикетке упаковки; 3) комплемент в установленном титре; 4) ге­молизин в рабочем титре; 5) взвесь отмытых эритроцитов барана 1: 40; 6) физиологический раствор NaCI. Исследуемые сыворотки разливают в два ряда пробирок. Для любого количества исследуе­мых сывороток в качестве контроля используют заведомо пози­тивную сыворотку (дающую положительный результат) и нор­мальную (от здорового животного, дающую отрицательный ре­зультат).

Пробирки с компонентами бактериолитической системы встряхивают, помещают в водяную баню на 20...40 мин при 37...38°С. Пробирки бактериолитической системы второго ряда без антигена встряхивают, помещают в водяную баню при тех же условиях.

Затем во все пробирки первого и второго ряда добавляют ком­поненты гемолитической системы, вторично помещают в водяную баню на 10..15 мин. Во всех пробирках второго ряда без антигена наступает полный гемолиз.

До получения оконча­тельного результата пробир­ки оставляют при комнат­ной температуре на 18...24 ч. Во всех пробирках без анти­гена, независимо, от боль­ного или от здорового жи­вотного получена сыворотка, должен наступить гемолиз, в пробирках первого ряда с антиге­ном более четкий результат выражен при отстаивании.

Показания реакции в пробирках с испытуемыми сыворотками считают достоверными, если в пробирках с позитивными сыво­ротками и антигеном гемолиз отсутствует при полном гемолизе в пробирках с позитивной сывороткой без антигена и во всех про­бирках с заведомо нормальной сывороткой (рис. 61).

Данная реакция должна сопровождаться контролями антигена, комплемента, гемолизина, эритроцитов. Для этого в отдельные пробирки наливают антиген с эритроцитами барана; комплемент с эритроцитами без гемолизина; гемолизин с эритроцитами без комплемента; эритроциты и физиологический раствор. Объем в каждой пробирке доводят физраствором до 2,5 мл. Пробирки встряхивают, помещают в водяную баню при 37 °С на 20 мин. Во всех контрольных пробирках гемолиз должен отсутствовать.

Результат РСК принято выражать в «крестах». Показатели по­ложительного результата реакции: + + + + (///) - полное осаж­дение эритроцитов (нет гемолиза), жидкость над осадком бесцвет­ная, + + + (///) - жидкость над осадком едва заметно окрашена в желтоватый цвет. Сомнительный результат реакции: наличие осевших на дне эритроцитов и частичное окрашивание надосадоч-ной жидкости за счет лизиса некоторой части эритроцитов обо­значают + + - (++), то есть два и два с половиной креста. Резко выраженный гемолиз (без осадка) или с небольшим осадком (+) - отрицательный результат.

Реакция длительного связывания комплемента (РДСК). Более эффективная по чувствительности в отличие от обычной класси­ческой РСК. Суть реакции заключается в том, что бактериолити-ческую систему выдерживают при трех различных температурных режимах: после смешения компонентов при комнатной темпера­туре 15 мин, затем при низкой температуре (4 °С) в рефрижераторе 18...20 ч и в водяной бане 15 мин. После этого добавляют гемоли­тическую систему, встряхивают, вновь помешают в водяную баню и производят учет реакции, как при РСК. Подтверждена эффек­тивность РДСК при диагностике ряда инфекционных болезней (туберкулез, вибриоз, бруцеллез идр,).

Реакция подавления связывания комплемента (РПСК), или реак­ция торможения, непрямая РСК. В данной реакции участвует еще один компонент - стандартная иммунная сыворотка, содержащая антитела к антигену, используемому обычно для диагностики и, следовательно, положительно реагирующая в классической РСК.

Исследуемую сыворотку смешивают с антигеном и некоторое время выдерживают без комплемента. Затем добавляют компле­мент и стандартную сыворотку, пробирки встряхивают и помеща­ют в водяную баню на 20...30 мин, после чего добавляют гемоли­тическую систему и вновь ставят в водяную баню. Если нет гемо­лиза-результат отрицательный, потому что испытуемая сыво­ротка не реагировала с антигеном и последний вступил в реакцию со стандартной сывороткой, связав комплемент. Если исследуемая сыворотка от больного животного, она содержит специфические антитела по отношению к антигену, т. е. происходит реакция меж­ду антигеном и антителами, не связывая комплемент. Антиген, взаимодействуя с антителами исследуемой сыворотки, не вступает в реакцию (подавляется) со стандартной (заведомо известной спе­цифической) сывороткой, комплемент остается свободным и вступает в реакцию в гемолитической системе - происходит гемо­лиз, результат реакции положительный по отношению к исследуе­мой сыворотке.

Метод флуоресцирующих антител (МФА). Возможности данно­го метода обусловлены специфичностью первой фазы серологи­ческих реакций с высокой чувствительностью люминесцентного анализа. Для осуществления МФА необходимо иметь высокоспе­цифические иммунные люминесцирующие сыворотки. Известно, что в различных серологических реакциях, используемых в мик­робиологической практике, участвуют преимущественно три ком­понента: бактерийный антиген, антитело и комплемент. Все три компонента, по сути, являются антигенами, и против каждого из них могут быть получены иммунные сыворотки и, соответствен­но, люминесцирующие антитела. В зависимости от того, какого типа люминесцируюшую сыворотку используют (против бакте­рийного антигена, антибактериальных антител, комплемента), различают три основных варианта метода флуоресцирующих ан­тител: прямой (1) и непрямой (2) варианты и модификация непря­мого варианта с использованием комплемента. Иммунологичес­кая реакция между антигеном и антителом осуществляется в этих модификациях непосредственно на предметном стекле. Для фик­сации микроорганизмов применяют органические растворители: ацетон, этанол, метанол, диоксан, а также обычные фиксаторы, используемые в микробиологической практике: формалин, смесь Никифорова, жидкость Карнуа и др.

Прямой вариант. На готовый препарат наносят специ­фическую люминесцирующую сыворотку на определенное время, затем излишек сыворотки сливают, препарат промывают и про­сматривают в люминесцентном микроскопе. Этот метод применя­ют для обнаружения бактерий в патологическом материале, объектах внешней среды, а также для идентификации возбудите­лей заболеваний в культурах.

Непрямой (двухступенчатый) вариант. На первом этапе происходит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом немеченой сыворотки. На втором этапе специфическое немеченое антитело связывается с антивидо-вым люминесцирующим антителом, содержащимся в сыворотке животного, иммунизированного глобулинами (или цельной сыво­роткой крови) того вида животных, от которых была использована иммунная сыворотка.

Непрямой антикомплементарный (трех­ступенчатый) вариант. Первый этап: образование ком­плекса антиген - немеченое антитело. Второй этап: наслаивание нормальной сыворотки, содержащей комплемент. Третий этап: комплекс антиген - антитело - комплемент обрабатывают люми-несцируюшей антикомплементарной сывороткой, приготовлен­ной при иммунизации кроликов сывороткой того вида животного, которое служило источником комплемента.

Непрямые варианты МФА можно использовать как для выяв­ления антигенов, так и для определения антител. Кроме того, для постановки двухступенчатого варианта нужно иметь ограничен­ный набор антивидовых люминесцирующих сывороток (против глобулинов быка, барана, лошади, свиньи и др.), а для антикомп­лементарного варианта достаточно иметь всего одну люминесци­рующую сыворотку против глобулинов морской свинки.

Методика и м м у н о л ю м и н е с u e н т н о и мик­роскопии. В практике ветеринарных бактериологических ла­бораторий используют люминесцирующие сыворотки биофабрич­ного производства. В зависимости от типа флуорохрома люминес­цирующие сыворотки обеспечивают либо зеленое свечение объек­та (краситель на основе флуоресценна), либо красное (краситель на основе родамина).

Для проведения иммунолюминесцентной микроскопии следу­ет на обезжиренное тонкое без царапин предметное стекло нанес­ти исследуемый материал. При исследовании органов и тканей животных готовят препараты-отпечатки тонким слоем. Препара­ты подсушивают на воздухе и помещают в фиксирующую жид­кость (этанол - 15 мин, метанол - 5 мин, ацетон - 5 мин). Если необходимо, после фиксации препараты некоторое время можно сохранять в холодильнике. Последовательность и дальнейшие процедуры зависят от применяемого варианта МФА (одноступен­чатый, двухступенчатый, трехступенчатый). Обработку препаратов люминесцирующими сыворотками, а также немечеными сы­воротками первой ступени и комплементом проводят при 37 X в условиях влажной камеры {чашки Петри с увлажненной фильтро­вальной бумагой) .

Одноступенчатый вариант. На предметное стекло с фиксиро­ванным исследуемым материалом наносят люминесцирующую сыворотку (в разведении, указанном на ампуле). Препарат поме­щают во влажную камеру на 15...20 мин при 37 "С. Затем его про­мывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,4) в со­суде, меняя раствор через 5...10 мин несколько раз, или под струей водопроводной воды в течение 3...5 мин. Вода должна быть нейт­ральной и не содержать железа. Затем препарат (на одном стекле может быть несколько мазков) подсушивают на воздухе или филь­тровальной бумагой, после чего наносят каплю забуференного глицерина с рН 8,0 и покрывают покровным стеклом. На покров­ное стекло наносят иммерсионную нефлуоресцирующую жид­кость и микроскопируют.

Двухступенчатый вариант. На предметное стекло с исследуе­мым материалом наносят каплю иммунной немеченой сыворотки первой ступени. Препарат помещают в термостат в условиях влаж­ной камеры на 15...20 мин. Затем его промывают, как описано выше, подсушивают и наносят каплю люминесцирующей антиви-довой сыворотки. Препарат снова помещают в термостат в усло­виях влажной камеры на 15...20 мин. Повторяют процедуру про­мывания и высушивают фильтровальной бумагой. Наносят забу-ференный глицерин, покрывают покровным стеклом, наносят не­флуоресцирующую иммерсионную жидкость и микроскопируют.

Трехступенчатый вариант (антикомплементарный). На пред­метное стекло с исследуемым материалом наносят каплю иммун­ной немеченой сыворотки первой ступени. Препарат помещают в термостат, как описано выше, подсушивают и на мазок наносят каплю комплемента. Препарат вновь помещают во влажную каме­ру и в термостат на 15...20 мин, после чего промывают и наносят люминесцирующую антикомплементарную сыворотку. Последу­ющие процедуры аналогичны одноступенчатому варианту.

Приготовление и обработка конт­рольных препаратов. 1. Для прямого варианта с целью определения специфичности реакции между антигеном с люминес­цирующей сывороткой следует этой же сывороткой обработать пре­параты-мазки из гетерологичных видов микробов. Эти виды долж­ны быть близкие в антигенном отношении, но отличающиеся по морфологии от исследуемых микроорганизмов; далекие в антиген­ном отношении к исследуемым микроорганизмам, но сходные по морфологии и распространению с ними. Препараты-отпечатки об­рабатывают люминесцирующей нормальной сывороткой.

2. Для непрямого варианта необходимо иметь три контрольных препарата, обработанных нормальной сывороткой, люминесцирующей антивидовой сывороткой без иммунной немеченой сыво­ротки и люминесцирующей антивидовой сывороткой с заведомо иммунной сывороткой первой ступени.

3. Для непрямого варианта с комплементом необходимы конт­рольные препараты, при обработке которых иммунная сыворотка заменена нормальной сывороткой того же вида и в тех же разведе­ниях, а также препараты, обработанные всеми ингредиентами, кроме иммунной сыворотки.

Оценка результатов. Учитывают яркость, цвет, ло­кализацию и структуру свечения. Бактерии, окрашенные люми­несцирующей сывороткой, меченной изотиоцианатом флуоресце-ина, имеют яркое зеленое свечение по периферии в виде ободка или ореола, центральная часть светится слабо. Такое свечение на­зывается специфическим в отличие от неспецифического, когда все тело клетки светится равномерно. Чем более выпукло лежит бактерийная клетка в препарате, тем резче ободок. Объяснить та­кое свечение можно тем, что с единицы площади «периферии» клетки на сетчатку глаза наблюдателя проецируется в несколько раз больше антител, чем с центральной части клетки микроба. Следует иметь в виду, что у пластичных клеток (лептоспиры, виб­рионы) нет контура или он заметен слабо. У клеток, погруженных в тканевую жидкость, и у молодых бацилл сибирской язвы контур обычно выражен нерезко.

Интенсивность свечения оценивают по четырехкрестовой сис­теме: + + + + - очень яркая флуоресценция по периферии мик­робной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки; + + + - яркая флуоресценция периферии клетки; + + - слабое све­чение периферии клетки; + - нет контрастного свечения перифе­рии тела микробной клетки. Отсутствие специфического свечения обозначают «-» (видны тени микроорганизмов). При диагностике различных возбудителей положительным результатом чаще всего считают специфическое свечение бактерийных клеток не ниже чем на четыре или на три креста.

Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная двухэтапная серологическая реакция. В ней используют пять ингредиентов, составля­ющих две системы: антиген, антитело, комплемент (первая система); эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) гемолитической сывороткой, содержащей специфические к ним антитела (вторая, или индикаторная, гемсистема). При этом взаимодействие антитела с антигеном на первом этапе реакции приводит к образованию иммунного комплекса, который адсорбирует комплемент, но визуально обнаружить это невозможно. В качестве индикатора связывания комплемента на комплексе антиген–антитело на втором этапе используют гемсистему, кото­рая, являясь иммунным комплексом, тоже способна адсорбировать его. В конечном итоге возможны два вариан­та результата реакции. Если антитело и антиген соответствуют друг другу и комплемент адсорбируется образовав­шимся комплексом, лизиса эритроци­тов гемсистемы не произойдет. При несоответствии антитела антигену, и наоборот, комплемент, оставаясь сво­бодным, присоединится к гемсистеме и вызовет гемолиз.

Как и другие серологические ре­акции, РСК можно использовать для выявления специфических антител по известному антигену или для определе­ния антигена по известным антителам.

Общая характеристика ингредиен­тов РСК.

1. ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА перед постановкой реакции прогрева­ется на водяной бане 30 мин для инактивации ее собственного комплемента и разводится начиная с 1:5.

2. АНТИГЕНОМ могут быть культуры бактерий, их лизаты, вирусы и вирус–содержащие материалы, экстракты па­тологически измененных органов и тканевые липиды.

3. КОМПЛЕМЕНТ – сыворотка мор­ских свинок, полученная в день опыта. В настоящее время используется производственный сухой комплемент.

4. ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов барана по осадку. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин.

Постановка основного опыта РСК. В 1 пробирку вносят СЫВОРОТКУ, АНТИГЕН И КОМПЛЕМЕНТ, во вторую – сыворотку, комплемент и вместо антигена изотонический раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ), в третью – антиген, комплемент и тот же раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ АНТИГЕНА). Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 1ч. Одновременно готовят гемолитическую систему, которую затем добавляют во все три пробирки после извле­чения штатива из термостата. Смешав гемсистему с ингредиентами трех пробирок, последние вновь ставят в термостат на 1 ч, и спустя это время учитывают результаты РСК.

При учете РСК интенсивность реакции обозначается плюсами: «++++»– резко положительная реакция с полной задержкой гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты осели на дно; «+++», «++» –положительная реакция, отличается нарастанием окраски жид­кости вследствие гемолиза и уменьшения количества эритроцитов в осад­ке; «+» – слабоположительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов. Отрицательная реакция обозначается знаком «–», при этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно–розовую окраску («лаковая кровь»).

РСК – весьма сложная, но очень чувствительная специфическая реакция. Широко применяется в диагностике сифилиса, хронической формы гонореи, коклюша, актиномикоза, всех риккетсиозов и вирусных инфекций.

Иммуноферментный анализ.

Метод был разработан в начале 70-х гг независимо друг от друга тремя группами учёных. Метод напоминает РИА, но в его основу положено маркирование Аг или Ат, вступающего в реакцию, ферментом. Взд метки с субстратом обычно сопровождается изменением окраски среды. В настоящее время созданы многочисленные модификации этого метода, но наибольшее распространение получил гетерогенный ИФА на твёрдой фазе (твердофазный). Различают:

1) ПРЯМОЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА. В этом случае:

1. сыворотку с Ат инкубируют с Аг, фиксированным на твёрдом субстрате (чаще всего это пластиковая микропланшетка).

2. Ат, не связавшие Аг, удаляют многократным промыванием.

3. Вносят меченную ферментом сыворотку к Ат, связавшим Аг.

4. Определяют ко-во фермента–маркёра, связавшегося с Ат.

2) КОНКУРЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА.

1. Вносят сыворотку. Если в ней есть специфические Ат, то они связываются с Аг, фиксированном на твёрдом субстрате. Если специфических Ат нет, то Аг оказывается не связанным.

2. При добавлении специфических к фиксированному Аг Антител в первом случае им будет не с чем взаимодействовать (большинство Аг уже связаны) Þ содержание маркёра низкое. Во втором случае специфические Ат будут связываться с Аг и при отмывании они не будут смываться Þ высокое содержание маркёра.

Аналогично м.б. фиксированы АНТИТЕЛА, и различные фирмы выпускают именно планшеты с уже фиксированными Ат.

По сравнению с классическими методами выявления Аг этот метод позволяет непосредственно регистрировать их взаимодействие с Ат, а не вторичные проявления (агглютинацию, преципитацию или гемолиз). Метод очень ЧУВСТВИТЕЛЕН (достаточно концентрации 1нг/мл).

Определяют: Хламидии, клостридии, ВИЧ и др.

8. Реакция фагоцитоза.

Фагоцитоз осущ-ся микрофагами и макрофагами. Стадии фагоцитоза: приближение, прилипание, погружение, переваривание.

Оценка функциональной активности фагоцитирующих клеток.

Колич. оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов производят в цельной крови, в лейкоцитарной взвеси или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют монодисперсные частицы латекса диаметром 1,0-2,0 мкм, суспензию убитых нагреванием бактерий или дрожжеподобных грибов.

Фагоциты смешивают с фагоцитируемым материалом в соотношении 1:10 или 1:100 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Затем пробирки центрифугируют и осадок ресуспензируют в капле сыворотки крови для приготовления мазка. В мазках, фиксированных краской Май-Чрюнвальда и окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток (ФП – фагоцитарный показатель) и кол-во поглощенных частиц на 1 клетку (ФЧ – фагоцитарное число).

У здорового человека ФП=40-80%, ФЧ=1-5.

9. Диагностикумы.

Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или формалином определенных микробных клеток с известным содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена могут быть использованы также взвеси живых бактерий. Феномен реакции проявляется предварительно через два часа (при 37 0 С), окончательный результат учитывается при комнатной температуре через 18-20 часов. Для диагностики представляет интерес положительная реакция только в опре-деленном титре сыворотки, который служит диагностическим. Так, при бруцеллезе диагностический титр 1:200, а при туля-ремии -1:100. Для выявления антител можно ставить экспрессные реак-ции агглютинации (время учета несколько минут). Например: 1. Кровяно-капельная реакция при туляремии. В каплю цельной крови больного на специальном стекле наносят кап-лю дистиллированной воды (для гемолиза) и каплю туляре-мийного диагностикума. Реакция происходит в течение 1-2 минут, хорошо видны агглютинаты в виде белесых комочков. 2. На стекле проводится экспрессная реакция агглютина-ции по Хеддельсону при бруцеллезе.

Данные реакции не позволяют определить количество ан-тител в сыворотке.б) для идентификации чистой культуры возбудителей ин-фекционных болезней. С этой целью используются иммунные диагностические

агглютинирующие сыворотки, выпускаемые институтамивакцин и сывороток, путем иммунизации животных целымимикробными клетками. Для достоверности сыворотки лучше использовать адсор-бированные, чтобы в них содержались только антитела, соот-ветствующие определенному виду или типу микроорганизма.

Принципы получения иммунных сывороток.

Иммунная сыворотка (антисыворотка) представляет собой сыворотку крови, содержащую антитела к данному антигену. В большинстве случаев иммунные (диагностические) сыворотки к микробным, тканевым и другим антигенам получают экспериментальным путем, иммунизируя животных соответствующими антигенами.

В числе основных требований, предъявляемых к антисывороткам, - их высокая специфичность и достаточное содержание антител. По специфичности различают поливалентные (полиспецифические) и моновалентные (моноспецифические) антисыворотки. Поливалентные сыворотки содержат антитела ко многим антигенам, моноспецифические - к одному конкретному антигену. Получить моноспецифические сыворотки можно:

1) используя для иммунизации животных высокоочищенные антигены,

2) очищая нативные сыворотки от антител нежелательной специфичности.

Для этого используют:

1) иммуноаффинный метод, в основе которого лежит связывание антител определенной специфичности соответствующими антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, с последующим разделением образовавшихся комплексов АГ -АТ и выделением антител;

2) метод адсорбции по Кастеллани. Для этой цели к нативной иммунной сыворотке, содержащей группоспецифические перекрестно реагирующие антитела, последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят все групповые антигены, адсорбируя таким образом гомологичные анти-

тела. Такие адсорбированные моноспецифические антисыворотки содержат антитела к различным детерминантам молекулы антигена, которые гетерогенны по классовой (подклассовой)

Страница 33 из 91

Реакция связывания комплемента (РСК)
Соединение антитела с антигеном и комплементом не обязательно сопровождается разрушением антигена. Это. в большей степени относится к микробам, которые проявляют устойчивость к литическому действию комплемента. Происходящее в таких случаях связывание комплемента может быть выявлено непрямым путем с помощью метода, открытого Ж. Борде и С. Жангу. Сущность метода заключается в следующем. При взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном происходит соединение антигена с антителом, образуется комплекс антитела с антигеном, который связывает комплемент. В случае несоответствия антигена и антитела связывания комплемента не происходит, т. е. комплемент остается свободным. Процесс связывания комплемента при положительной реакции антитела с антигеном остается невидимым. Поэтому для определения, связался ли комплемент или остался свободным, в качестве индикатора в реакцию вводится гемолитическая система (гемолитическая сыворотка - гемолизины и эритроциты барана). Реакция связывания комплемента ставится в две фазы: в первой фазе к исследуемой сыворотке (антителу) добавляется антиген и комплемент, во второй - добавляется гемолитическая система.
Если в первой фазе реакции исследуемая сыворотка содержит специфические для антигена антитела, то комплемент будет связан с комплексом антиген+антитело, при добавлении гемолитической системы гемолиз не произойдет и реакция будет считаться положительной.
Если же исследуемая сыворотка не содержит специфических антител, т. е. антиген и антитела не соответствуют друг другу, тогда комплемент в первой фазе реакции остается свободным и при добавлении гемолитической системы произойдет гемолиз (растворение) эритроцитов, т. е. реакция будет отрицательной (см. рис. 57).
Реакция Борде-Жангу (реакция связывания комплемента), обладающая высокой чувствительностью, приобрела большое диагностическое значение. Это значение еще больше увеличилось, когда Жангу показал, что реакция может происходить не только с бактериальными телами, но и с их экстрактами. Реакция Борде-Жангу применяется при диагностике сапа, гонореи и других заболеваний. А. Вассерман, исходя из идеи Ж. Борде, применил реакцию связывания комплемента для серодиагностики, сифилиса. Эта реакция получила практическое применение в распознавании сифилиса.
Реакция связывания комплемента применяется с двоякой целью:

1. Для обнаружения в сыворотке специфических антител с помощью известного антигена. Например, имея антиген, приготовленный из культуры гонококка, можно обнаружить гонококковые антитела в сыворотке больного. В этом случае необходимо пользоваться антигеном, доза которого, связывающая комплемент, заранее вытитрована на значительном количестве сывороток больных.
2. Для определения вида антигена при помощи сыворотки, содержащей антитела к определенному антигену. Например, при помощи соответствующей иммунной сыворотки можно идентифицировать палочку коклюша. В этих случаях необходимо иметь сильную иммунную сыворотку, титр которой известен.

Ингредиенты (составные части) реакции. Для реакции связывания комплеме-нта необходимы следующие ингредиенты: 1) эритроциты барана, 2) гемолитическая сыворотка, 3) комплемент, 4) антиген и 5) испытуемая сыворотка.
1. Эритроциты получают из дефибрин ированной крови барана. Для этого у барана берут кровь из яремной вены непосредственно в банку со стеклянными бусами. Встряхивают в течение 10 минут. Процеживают через стерильную марлю, центрифугируют и сыворотку отсасывают. Три раза отмывают эритроциты от остатка сыворотки физиологическим раствором хлористого натрия центрифугированием в течение 10-15 минут. После третьего центрифугирования из осадка приготовляют 3% взвесь эритроцитов для опыта. При хранении в леднике дефибринированная кровь может употребляться в течение 6-8 дней.

Схема приготовления разведений гемолитической сыворотки из основного разведения 1: 100

1. Гемолитическая сыворотка обычно получается от кроликов, иммунизированных эритроцитами барана. Гемолитическую сыворотку выпускают в сухом виде институты бактерийных препаратов. На этикетке ампулы указан титр сыворотки и срок годности.

Таблица 4
Схема титрования гемолитической сыворотки

Титром гемолитической сыворотки называется ее предельное разведение, способное в объеме 0,5 мл растворить 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов в присутствии 0,5 мл комплемента в течение часа при температуре 37°.
Титр гемолитической сыворотки определяется по следующей схеме: приготовляют основное разведение выворотки 1: 100 (0,1 мл сыворотки+0,9 мл физиологического раствора), из которого готовят дальнейшие разведения (табл. 3).
В ряд пробирок последовательно отмеривают по 0,5 мл полученных разведений гемолитической сыворотки, начиная с 1: 1000, добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл комплемента, разведенного 1:10, и по 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов. Титрование гемолитической сыворотки проводится по схеме (табл. 4).
Из схемы видно, что данная сыворотка еще в разведении 1: 1500 дает полный гемолиз (т. е. титр сыворотки 1: 1500). В дальнейшем для опыта берут в 3 раза меньшее разведение (тройной титр). Так, например, если титр гемолитической сыворотки 1: 1500, применяется разведение 1:500 (т. е. 0,1 мл сыворотки 49,9 мл физиологического раствора).

1. Комплемент. В качестве комплемента в реакции служит сыворотка морских свинок (их комплемент обладает наибольшей активностью) или сухой комплемент, выпускаемый институтами бактерийных препаратов.

Так как степень активности комплемента не у всех морских свинок одинакова, необходимо брать кровь у нескольких животных и полученные сыворотки смешивать.
Титром комплемента обозначается первая минимальная доза комплемента, растворяющая эритроциты. Если, например, в приведенной схеме титрования полный гемолиз произошел в пробирке, содержащей 0,3 мл комплемента, и неполный гемолиз оказался в пробирке, содержащей 0,25 мл комплемента, то титром комплемента надо считать 0,3 мл в разведении 1: 10. В качестве рабочей дозы комплемента обычно берется титр его, увеличенный на 20-25%, т. е. приблизительно это соответствует тому количеству комплемента, которое содержится в предпоследней пробирке с гемолизом.
Как при титровании гемолитической сыворотки, так и при титровании комплемента ставятся два контроля (см. табл. 5).

Схема титрования комплемента без антигена


Таблица 6
Схема титрования комплемента в присутствии антигена

Кроме того, рекомендуется титровать комплемент также в присутствии антигена.
Титрование комплемента в присутствии антигена необходимо в тех случаях, когда антиген подавляет титр комплемента (антикомплементарное свойство антигена). Это свойство может зависеть как от природы самого антигена, так и от способа его приготовления.

1. Антиген. В реакции связывания комплемента используются различные антигены. Антигенами являются культуры разнообразных микробов или экстракты патологически измененных или нормальных тканей. В качестве бактериального антигена могут употребляться как взвеси микробов в физиологическом растворе, так и экстракты из микробов, приготовленные различными способами (например, антиформиновый гонококковый антиген, спиртовой туберкулезный и т. п.). Хорошими антигенными свойствами обладает микробная взвесь, предварительно убитая парами формалина или обработанная алкоголем. Для реакции исходную взвесь антигена разводят по оптическому стандарту, содержащему. 1 млрд. микробных тел в 1 мл, и берут в объеме 0,5 мл.

В качестве антигена применяют также микробные лизаты в дистиллированной воде или физиологическом растворе, полученные в шюттель-аппарате (аппарат для встряхивания) или путем обработки антиформином.
Для реакции следует употреблять такую дозу антигена, которая вызывает полную задержку гемолиза с сыворотками, содержащими соответствующие гемолизины, но которая сама по себе задержки гемолиза не дает. В силу того, что все микробные антигены адсорбируют какое-то количество комплемента, перед титрованием их проверяют на антикомплементарные свойства, определяя растворяющую дозу комплемента, т. е. то наибольшее количество антигена, которое не вызывает задержки гемолиза. Определение такой растворяющей дозы антигена производится по схеме (табл. 7).
Из таблицы видно, что в данном примере растворяющая доза антигена составляет 0,4 мл. Для опыта берут половину такой дозы, т. е. ориентировочная доза будет равна 0,2 мл.

1. Испытуемая сыворотка. Сыворотку больного отделяют от сгустка через 3-48 часов после взятия крови и инактивируют в водяной бане при 56° в течение 30 минут.

Таблица 7 Схема определения растворяющей дозы антигена

Инактивированные сыворотки могут сохраняться в холодильнике в течение 5-6 дней. Для реакции сыворотка больного применяется в разведении 1:5 (0,1 мл сыворотки+0,4 мл физиологического раствора).
Постановка опыта реакции связывания комплемента (табл. 8).
Для постановки реакции связывания комплемента необходимы следующие ингредиенты:

1. физиологический раствор (0,85%);
2. сыворотка, подлежащая исследованию, инактивированная при 56° в течение 30 минут в водяной бане;
3. антиген (взвесь бактерий или экстракт из них), не вызывающий самостоятельно ни гемолиза, ни задержки его в дозе, установленной титрованием;
4. комплемент в рабочей дозе, установленной титрованием;
5. гемолитическая сыворотка в дозе, соответствующей ее утроенному титру;
6. 3% взвесь бараньих эритроцитов.

Каждый из ингредиентов, который применяется для реакции, берется в количестве 0,5 мл. Если доза отдельного компонента меньше этого объема, то ее дополняют физиологическим раствором до 0,5 мл.
Основной опыт связывания комплемента желательно ставить сразу с двумя - тремя антигенами, приготовленными различным способом (А1, А2, А3 в табл. 8).

Схема основного опыта

Для контроля необходимо одновременно ставить реакцию точно в тех же условиях с нормальной сывороткой и сывороткой, заведомо дающей положительный результат. При постановке реакции сначала смешивают исследуемую сыворотку, антиген и комплемент. Смесь выдерживают при 37° в течение часа. По истечении указанного срока в пробирку добавляют смесь гемолитической сыворотки и эритроцитов - гемолитическую систему. Гемолитическую систему добавляют или непосредственно после приготовления смеси из равных объемов гемолитической сыворотки и эритроцитов, или после получасового выдерживания этой смеси в термостате. Смесь всех ингредиентов после энергичного встряхивания помещают в термостат при 37° на 1 час, а затем на 12 часов переносят в холодильник или оставляют при комнатной температуре.
В пробирках, в которых произошел гемолиз, жидкость становится прозрачной, но окрашенной (см. рис. 58).

Рис. 58. Схема реакции связывания комплемента.
а - реакция положительная; б - реакция отрицательная.

Результат реакции обозначается или словами «положительная», «отрицательная» реакция, или знаком плюс (+) или минус (-). Но так как степень задержки гемолиза может колебаться в пределах от полной задержки до очень слабой, обозначения могут быть следующие:
(++ + +)-полная задержка гемолиза; жидкость не окрашена, значительный осадок эритроцитов;
(+ + +) -ясная задержка гемолиза; жидкость окрашена, осадок эритроцитов;
(++)-частичная задержка гемолиза; жидкость окрашена интенсивно; компактный осадок эритроцитов;
(+)-очень слабая задержка гемолиза; жидкость окрашена интенсивно, осадок небольшой;
(±) -следы задержки гемолиза, при взбалтывании заметен незначительный осадок;
(-)-полный гемолиз (отрицательная реакция).

Особое преимущество РСК состоит в том, что природа антигена, участвующего в ней (корпускулярный или растворимый), не имеет значения, так как комплемент связывается с Fc-фрагментом любого антитела, относящегося к IgG и IgM, независимо от его антительной специфичности. Кроме того, РСК очень чувствительна: она позволяет обнаружить количество антител в 10 раз меньшее, чем, например, в реакции преципитации. РСК была предложена в 1901 г. Ж. Борде и О. Жангу. В ее основе лежат два свойства комплемента:

1) способность связываться с комплексом "антиген + антитело";

2) лизирование эритроцитов, использованных для получения гемолитической сыворотки.

РСК ставят в два этапа, и в ней соответственно участвуют две системы - опытная, или диагностическая, и индикаторная. Диагностическая система состоит из исследуемой (или диагностической) сыворотки, которую перед постановкой реакции прогревают при 56 °С в течение 30 мин для инактивации имеющегося в ней комплемента, и антигена.

К этой системе добавляют стандартный комплемент. Его источником служит свежая или высушенная сыворотка морской свинки. Смесь инкубируют при 37 °С в течение одного часа. Если в исследуемой сыворотке имеются антитела, произойдет их взаимодействие с добавленным антигеном, и образующиеся комплексы "антиген + антитело" свяжут добавленный комплемент. Если же в сыворотке антитела отсутствуют, образования комплекса "антиген + антитело" не произойдет, и комплемент останется свободным.

Никаких видимых проявлений связывания комплемента на этой стадии реакции обычно нет. Поэтому для выяснения вопроса, произошло или нет связывание комплемента, добавляют вторую, индикаторную систему (инактивированная гемолитическая сыворотка + эритроциты барана), и смесь всех компонентов РСК вновь инкубируют при 37 °С в течение 30-60 мин, после чего оценивают результаты реакции. Используя смартфон (например, такой), можно рассчитать точное время реакции. В случае, если комплемент связался на первой стадии, в диагностической системе, т. е. в сыворотке больного имеются антитела, и произошло связывание комплемента комплексом "антитело + антиген", лизиса эритроцитов не будет - РСК положительна: жидкость бесцветна, на дне пробирки осадок эритроцитов.

Если же в сыворотке специфические антитела отсутствуют и связывания комплемента в диагностической системе не произойдет, т. е. РСК отрицательна, то неизрасходованный в диагностической системе комплемент связывается с комплексом "эритроциты + антитела" индикаторной системы и произойдет гемолиз: в пробирке «лаковая кровь», осадка эритроцитов нет. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Реакция сопровождается соответствующими контролями: контроль сыворотки (без антигена) и контроль антигена (без сыворотки), так как некоторые сыворотки и некоторые антигены обладают антикомплементарным действием. Перед постановкой РСК все компоненты, участвующие в ней, за исключением исследуемой сыворотки или антигена, подвергаются тщательному титрованию.

Особенно важно ввести в реакцию точную дозу комплемента, так как его нехватка или избыток могут привести к ложным результатам. Титром комплемента является то его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20-25% по сравнению с установленным титром. Титром гемолитической сыворотки является то ее максимальное разведение, которое, будучи смешано с равным объемом 10% раствора комплемента, полностью гемолизирует соответствующую дозу эритроцитов в течение 1 ч при температуре 37 °С.

Непрямая реакция гемолиза используется как ускоренный метод обнаружения специфических антител. В качестве носителя антигенов используют эритроциты. При наличии в сыворотке больного специфических антител сенсибилизированные эритроциты в присутствии комплемента лизируются.